2. A 16S rRNS alapú amplikon szekvenálás – erős, de korlátozott
A 16S rRNS-szekvenálás olcsó és jól validált, megbízhatóan megmutatja a főbb baktériumcsoportokat — de a bél ökoszisztémájának csak egy részét látja.
A 19. század végén a geológusok rájöttek, hogy a különböző kőzetrétegekben talált fosszíliák alapján következtetni lehet arra, mikor éltek az egyes fajok. A módszer briliáns volt – de volt egy alapvető korlátja: csak azokról az élőlényekről tudott képet adni, amelyek fosszilis maradványokat hagytak. A puhatestűek, a gombák, a legtöbb mikroba nyom nélkül tűnt el. A fosszilis adatbázis valós volt, de nem volt teljes. A 16S rRNS elemzés hasonló logika szerint működik: megbízhatóan mutatja azt, amit meg tud mutatni – de a bél ökoszisztémájának csak egy részét látja.
A 16S riboszomális RNS[G] gén minden prokariótában jelen van, de szekvenciája fajonként különböző – ez teszi lehetővé a baktériumok azonosítását. Az amplikon szekvenálás során a székletmintából DNS-t vonnak ki, a 16S gén egy meghatározott szakaszát (ún. variábilis régiót, V1–V9) felszaporítják, majd szekvenálják. Az eredmény egy összetétel-térkép: melyik baktériumtaxon milyen arányban van jelen a mintában [15].
A módszer előnyei valódiak. Viszonylag alacsony költséggel nagy mintaszámban elvégezhető. Jól validált adatbázisokkal dolgozik (SILVA, Greengenes). Alkalmas az emberi bélmikrobiom legjellemzőbb törzseinek azonosítására. Kutatási célra – különösen populációs vizsgálatokban – bevált eszköz [16].
Képzeljük el, hogy valaki feldobja a levegőbe egyszerre több ezer különböző LEGO-készlet összes elemét, majd a padlón szétszóródott darabokból kell megmondanunk, hogy eredetileg pontosan melyik készletek voltak ott, és belőlük hány darab. A nehézséget fokozza, hogy nem tudunk minden darabot felvenni – néhány az ágy alá gurult, néhány összetapadt, néhány pedig eleve annyira hasonlít a másikra, hogy szabad szemmel nem különböztethetők meg. Ez a 16S rRNS elemzés lényege: a bélből kivont DNS-ből olvassuk ki, hogy melyik baktérium-„készlet" volt ott – de csak egy jellegzetes elemet vizsgálunk mindegyikből (a 16S gén egy variábilis régióját), nem az egész készletet. Az eredmény valós, de hiányos kép: megmutatja a főbb csoportokat, de a hasonló elemek összetéveszthetők, az ágy alá gurult darabok (nem tenyészthető törzsek) láthatatlanok maradnak, és az sem derül ki, hogy egy-egy készletből pontosan hány darab volt jelen.
A módszernek azonban klinikailag súlyos, módszertanilag jól dokumentált korlátai is vannak. Ezekről részletesen az „5 alapvető korlát" subsection szól lent. Egy korlátot azonban érdemes itt is külön kiemelni:
Faji szintű azonosítás korlátai: A legtöbb 16S vizsgálat csak nemzetség szintjéig képes megbízhatóan azonosítani; faji vagy törzsi szintű megkülönböztetés sokszor nem lehetséges [15]. Ez klinikai szempontból kritikus lehet, mivel azonos nemzetségen belül kórokozó és ártalmatlan törzsek egyaránt előfordulnak.
Az értékelő algoritmusok: interpoláció és hallucinálás
Amikor a 16S szekvenálás nyers adatait – millió rövid DNS-töredéket – a szoftver feldolgozza, két kritikus lépésen megy át: a csoportosításon (OTU- vagy ASV-képzésen) és az adatbázis-illesztésen [15], [18]. Az OTU-képzés során a hasonló szekvenciákat egyetlen egységbe vonja össze a program; az ASV-módszer ezzel szemben egyes nukleotid-szintű különbségeket is figyelembe vesz. A két megközelítés ugyanabból az adatból eltérő „fajokat" azonosít.
Az adatbázis-illesztés során a program az ismeretlen szekvenciát hozzárendeli egy ismert baktériumhoz – de csak akkor, ha az adatbázisban van hozzá elegendően közeli referencia. Ha nincs, a szoftver interpolál: a legközelebbi ismert rokon alapján következtet arra, hogy „mi lehet" az ismeretlen organismus. Ez hasznos közelítés – de nem mérés. Az interpoláció azt jelenti, hogy amit a riportban látunk, részben valódi megfigyelés, részben algoritmikus becslés. A kettő a végeredményen általában nem megkülönböztethető [15], [18].
Súlyosabb eset, amikor a program hallucinál: olyan baktériumot „azonosít", amely valójában nincs jelen a mintában, csupán a szekvencia-hasonlóság alapján tévesen illesztette hozzá valamely adatbázis-bejegyzéshez. Ez különösen alacsony bőségű taxonoknál fordul elő, ahol egyetlen „téves olvasás" is százalékos jelenlétként jelenhet meg a kimutatásban. A jelenség nem elméleti: reprodukálhatósági vizsgálatokban rendszeresen megfigyelhető, hogy negatív kontrollokban – amelyek elvileg nem tartalmaznak baktériumot – is megjelennek „kimutatott" taxonok [17].
Árukategória (2024-es piaci adatok alapján): 50.000–150.000 Ft; premium csomagokban 200.000 Ft felett. Elvégzési idő: 2–6 hét. Klinikai döntési következmény: jelenleg korlátozott, elsősorban kutatási célra alkalmas.
Mit jelent mindez a beteg számára?
Ha valaki elvégeztet egy 16S rRNS alapú mikrobiom-vizsgálatot, az eredményül kapott riport általában tarka kördiagramokat, százalékos arányokat és referenciasávokat tartalmaz. Az értelmezés csábítóan egyszerűnek tűnik: ez az érték alacsony, az „optimális" tartomány felett vagy alatt vagyunk. A valóság azonban ennél jóval összetettebb [15], [16].
Először is, a „referencia-tartomány" meghatározása nem triviális. Az egészséges emberi mikrobiom[G] rendkívül nagy egyéni variabilitást mutat – két teljesen egészséges ember bélmikrobiota[G]-összetétele akár 90%-ban is különbözhet egymástól, miközben mindkettő funkcionálisan stabil és egészséges. Az „átlagos egészséges" mikrobiomhoz való hasonlítás ezért félrevezető lehet: a saját, egyéni „optimum" minden embernek más [18], [16].
Másodszor, a 16S vizsgálat csak azt mutatja, ki van jelen – nem azt, hogy mit csinálnak. Egy baktérium jelenléte önmagában nem jelenti, hogy aktív, hogy funkcionálisan releváns mennyiségben termel metabolitokat, vagy hogy éppen kóros folyamatban vesz részt. A géntérképtől a funkcionális aktivitásig több lépés vezet – és ezek közül a 16S egyiket sem méri [18].
Mindez nem jelenti azt, hogy a vizsgálatnak nincs értéke. Saját magával összehasonlítva – azonos módszer, azonos labor, azonos mintavételi protokoll mellett, időben ismételve – valóban képet adhat arról, hogy egy kezelés (például FMT) hatására hogyan változik a mikrobiom összetétele. Ez a követéses, longitudinális alkalmazás az, ahol a 16S diagnosztikának ma a legmeggyőzőbb klinikai haszna van [15], [18].
A 16S rRNS technológia 5 alapvető korlátja
A 16S rRNS-alapú amplikon szekvenálás technológiai eleganciája mellett a klinikai gyakorlatban öt egymástól független, módszertani szinten dokumentált korlát befolyásolja az eredmények megbízhatóságát:
1. Reagens- és laborkontamináció ("kit-ome"). A laborkészletekből, vegyszerekből és eszközökből származó DNS akár nagyobb háttérzajt okozhat, mint maga a vizsgált minta — különösen alacsony biomasszás minták esetén (alacsony baktérium-koncentráció) [17], [471]. Egy bélminta általában elég bő ahhoz, hogy a kontamináció ne legyen meghatározó, de bőr- vagy nyálkahártyaminta esetén a háttér jelentősen torzít.
2. Alacsony mintamennyiség — magas hibaarány. Minél kevesebb baktérium van a mintában, annál nagyobb arányban jelenik meg a szennyező DNS, és az eredmény teljesen félrevezető lehet [471]. Ez a klinikai gyakorlatban azt jelenti, hogy a mintavételi körülmények (időzítés, módszer, tárolás) közvetlenül befolyásolják a kimenetet.
3. V-régió-választás hatása a profilra. A 16S gén különböző hipervariábilis szakaszait (V1-V2, V3-V4, V4, V6-V8 stb.) más-más „univerzális" primer-pár célozza. Ugyanazon mintáról különböző V-régió-választással eltérő közösség-profil kapható; egyes baktérium-csoportok az egyik régióval jól, a másikkal rosszul detektálhatók [472]. Két labor két különböző primer-szettel ugyanarról a betegről különböző „mikrobiotát" jelenthet.
4. Inter-lab variabilitás. Az MBQC (Microbiome Quality Control) konzorcium kimutatta, hogy ugyanazon minta különböző laborokban, eltérő készletekkel és bioinformatikai pipelin-nal feldolgozva jelentősen eltérő eredményeket ad [16]. Klinikai vonatkozás: két különböző szolgáltatótól származó vizsgálat nem közvetlenül összehasonlítható.
5. Csak relatív arányok, nem mennyiség. A 16S (és a shotgun is) kompozíciós adatot ad: az egyes taxonok egymáshoz viszonyított arányát mutatja, nem az abszolút sejtszámukat. Ha egy taxon „megnő" a riportban, az valójában lehet, hogy más taxonok csökkentek mellette [23]. Az abszolút kvantifikáció (qPCR vagy flow cytometry kalibrációval) eltérő képet adhat — erről a II.4. fejezet szól részletesen.
Ezek a korlátok nem érvénytelenítik a 16S-t mint kutatási eszközt, de a klinikai döntéshozatalhoz szükséges interpretációs óvatosságot indokolnak.
Hivatkozások
[15] Jovel J, Patterson J, Wang W et al. Characterization of the human gut microbiome using 16S or WGS: a comparative study on the outcome of different analysis pipelines. Front Microbiol. 2016. Link
Jovel és munkatársai 16S rRNS- és teljes-genom shotgun (WGS) metagenomikát hasonlítanak össze azonos humán bélminta-szetten, az analitikai pipeline hatását vizsgálva. Bemutatják, hogy a taxonómiai felbontás, a megfigyelt diverzitás és a differenciális abundancia-eredmények reprodukálhatósága erősen függ a variábilis régió, referencia-adatbázis, OTU/ASV klaszterezés és bioinformatikai pipeline választásától. A WGS több faj- és funkció-szintű információt nyert, de drágább. A QIIME, mothur, MG-RAST és assembly-alapú pipeline-okat hasonlítják, melyek érdemben eltérő eredményt adnak. Minden analitikai lépés átlátható dokumentálását, és az egy-pipeline-os eredmények óvatos értelmezését javasolják.
[16] Sinha R, Abu-Ali G, Vogtmann E et al. Assessment of Variation in Microbial Community Amplicon Sequencing by the Microbiome Quality Control (MBQC) Project Consortium. Nature Biotechnology. 2017. Link
A Microbiome Quality Control (MBQC) baseline tanulmány 15 laboratórium és 9 bioinformatikai protokoll taxonómiai profilozási variabilitását mérte fel vakos székletmintákon, kemosztát- és mesterséges közösségi mintákon. A variabilitás leginkább a bioanyagminta típusától és eredetétől függött, ezt követte a DNS-kivonás, a mintakezelési környezet és a bioinformatikai csővezeték. A mesterséges közösségek elemzése kvantitatív különbségeket mutatott a kivonási hatékonyságban és a bioinformatikai osztályozásban. Az eredmények kiemelik a standardizáció szükségességét a populációszintű mikrobiomvizsgálatok meta-analíziséhez.
[17] Salter SJ, Cox MJ, Turek EM et al. Reagent and Laboratory Contamination Can Critically Impact Sequence-Based Microbiome Analyses. BMC Biology. 2014. Link
A kontamináló DNS mindenütt jelen van a gyakran használt DNS-kivonó kitekben és laboratóriumi reagensekben, összetétele kitenként és gyártási tételenként jelentősen eltér. Ez a kontamináció kritikusan torzítja az alacsony mikrobiális biomasszájú minták 16S rRNS-gén-felmérésekből és shotgun-metagenomikából származó eredményeit. A szerzők kiterjedt listát adnak a lehetséges szennyező nemzetségekről és iránymutatást a hatás csökkentésére, valamint óvatosságra intenek a szekvencia-alapú technikák alkalmazásában alacsony biomasszájú környezetekben.
[18] Gloor GB, Macklaim JM, Pawlowsky-Glahn V, Egozcue JJ. Microbiome datasets are compositional: and this is not optional. Front Microbiol. 2017. Link
A 16S rRNS-amplikonok, metagenomok vagy metatranszkriptomok nagy áteresztőképességű szekvenálásával előállított mikrobiom-adatkészletek inherensen kompozícionálisak, mert a műszer önkényes összegzést kényszerít rá. A review bemutatja azokat a torzulásokat, amelyek a kompozíciós adatok nem kompozíciós módszerekkel való elemzéséből erednek, és iránymutatást ad a kompozíciós adatelemzés alkalmazására a mikrobiom-vizsgálatok teljes munkafolyamatában. A kompozíciós keret nem opcionális, hanem alapvető a valid következtetésekhez.
[23] Vandeputte D, Kathagen G, D'hoe K et al. Quantitative Microbiome Profiling Links Gut Community Variation to Microbial Load. Nature. 2017. Link
A hagyományos szekvenálás-alapú székletmikrobiota-elemzések csak relatív abundanciákat adnak, ami akadályozza a mikrobiom-jellemzők és a kvantitatív gazdaparaméterek összekapcsolását, ha a mikrobiális terhelés mintánként eltér. A szerzők szerint a relatív profilozás elfedheti a teljes mikrobiota-abundancia változását mint kulcsfontosságú betegségasszociált jelet, és kvantitatív mikrobiom-profilozást javasolnak, amely a relatív összetételt sejtsűrűségi adatokkal párosítja a gazda-mikrobiota interakciók valódi jellemzéséhez.
[471] Eisenhofer R, Minich JJ, Marotz C et al. Contamination in Low Microbial Biomass Microbiome Studies: Issues and Recommendations. mSystems. 2019. Link
A csökkenő mikrobiális biomassza 16S rRNA-szekvenálásra gyakorolt hatásának értékelésére a szerzők mintaközösség-hígítási sort hoztak létre, és négy számítógépes dekontaminálási megközelítést teszteltek: negatív kontroll szekvenciák alapján, relatív abundancia alapján, DNS-koncentrációval ellentétes korreláció alapján (Decontam) és kontaminációforrás-modellezéssel (SourceTracker). A kontamináns bakteriális DNS aránya a kiindulási biomassza csökkenésével nőtt, és a legjobban hígított mintában elérte a 80,1%-ot. A benchmark gyakorlati útmutatást ad a dekontaminációs módszerek megválasztásához alacsony biomasszájú mikrobiom-vizsgálatokban, és rámutat az in silico megközelítések korlátaira.
[472] Yang B, Wang Y, Qian PY. Sensitivity and Correlation of Hypervariable Regions in 16S rRNA Genes in Phylogenetic Analysis. BMC Bioinformatics. 2017. Link
A Normative Aging Study-ban binomiális modellel vizsgálták a metabolikus szindróma indexe és a DNS-metiláció közötti összefüggést. 659 alany 484 548 CpG-markerén Iterative Sure Independence Screening (ISIS) eljárást alkalmaztak elastic-net büntetéssel. A szűrési lépés szignifikánsan javította az elastic-net teljesítményét. A módszer négy CpG-t azonosított, amelyek két biológiailag releváns, funkcionális génhez köthetők. E markerek gyakorlati jelentőséggel bírhatnak a metabolikus szindróma megelőzésében és kezelésében.