II. 2. 16S-rRNA-basierte Amplikon-Sequenzierung – leistungsfähig, aber begrenzt
Die 16S-rRNA-Sequenzierung ist kostengünstig und gut validiert und zeigt die großen Bakteriengruppen zuverlässig – dennoch sieht sie nur einen Teil des Darmökosystems.
Im späten 19. Jahrhundert erkannten Geologen, dass Fossilien aus verschiedenen Gesteinsschichten verraten können, wann bestimmte Arten gelebt haben. Die Methode war brillant – hatte aber eine grundlegende Grenze: Sie konnte nur Organismen abbilden, die fossile Überreste hinterließen. Weichtiere, Pilze und die meisten Mikroben verschwanden spurlos. Die Fossilüberlieferung war real, aber unvollständig. Die 16S-rRNA-Analyse folgt einer ähnlichen Logik: Sie zeigt zuverlässig, was sie zeigen kann – doch sie sieht nur einen Teil des Darmökosystems [456].
Das Gen der 16S-ribosomalen RNA kommt in jedem Prokaryoten vor, doch seine Sequenz unterscheidet sich zwischen den Arten – genau das macht die Identifizierung von Bakterien möglich. Bei der Amplikon-Sequenzierung wird DNA aus einer Stuhlprobe extrahiert, ein definierter Abschnitt des 16S-Gens (eine sogenannte variable Region, V1–V9) amplifiziert und anschließend sequenziert. Das Ergebnis ist eine Zusammensetzungskarte: welches bakterielle Taxon in welchem Anteil in der Probe vorhanden ist.
Die Vorteile der Methode sind real. Sie lässt sich bei großen Probenzahlen zu vergleichsweise geringen Kosten durchführen. Sie arbeitet mit gut validierten Datenbanken (SILVA, Greengenes). Sie ist in der Lage, die charakteristischsten Phyla des menschlichen Darmmikrobioms zu identifizieren. Für Forschungszwecke – insbesondere in Populationsstudien – ist sie ein bewährtes Werkzeug [162].
Die Methode hat klinisch bedeutsame, methodisch dokumentierte Grenzen. Diese werden im untenstehenden Abschnitt "Die fünf grundlegenden Grenzen" ausführlich besprochen. Eine Einschränkung verdient es, gesondert hervorgehoben zu werden:
Grenzen der Identifizierung auf Artebene: Die meisten 16S-Analysen können nur bis zur Gattungsebene zuverlässig identifizieren; eine Differenzierung auf Art- oder Stammebene ist oft nicht möglich. Das kann klinisch entscheidend sein, da pathogene und harmlose Stämme innerhalb derselben Gattung vorkommen können.
Stellen Sie sich vor, Tausende verschiedener LEGO-Sets würden mit allen ihren Teilen gleichzeitig in die Luft geworfen, und aus den über den Boden verstreuten Teilen müssten wir genau bestimmen, welche Sets dabei waren und wie viele Teile jedes hatte. Erschwerend kommt hinzu, dass wir nicht jedes Teil aufheben können – einige sind unter das Bett gerollt, einige sind aneinander hängen geblieben, und einige sehen anderen so ähnlich, dass sie mit bloßem Auge nicht zu unterscheiden sind. Das ist das Wesen der 16S-rRNA-Analyse: Wir lesen aus der Darm-DNA ab, welches bakterielle "Set" vorhanden war – aber wir untersuchen von jedem nur ein charakteristisches Element (eine variable Region des 16S-Gens), nicht das ganze Set. Das Ergebnis ist ein reales, aber unvollständiges Bild: Es zeigt die Hauptgruppen, doch ähnliche Elemente können verwechselt werden, Teile unter dem Bett (nicht kultivierbare Stämme) bleiben unsichtbar, und wir können nicht genau sagen, wie viele Teile aus jedem Set vorhanden waren.
Analytische Algorithmen: Interpolation und Halluzination
Wenn Software die Rohdaten der 16S-Sequenzierung verarbeitet – Millionen kurzer DNA-Fragmente –, durchläuft sie zwei kritische Schritte: das Clustering (Bildung von OTUs oder ASVs) und den Datenbankabgleich [163]. Bei der OTU-Bildung werden ähnliche Sequenzen zu einer einzigen Einheit zusammengefasst; die ASV-Methode berücksichtigt dagegen Unterschiede bis auf die Ebene einzelner Nukleotide. Die beiden Ansätze identifizieren aus denselben Daten unterschiedliche "Arten".
Beim Datenbankabgleich ordnet das Programm eine unbekannte Sequenz einem bekannten Bakterium zu – aber nur, wenn es in der Datenbank eine hinreichend ähnliche Referenz gibt. Gibt es keine, so interpoliert die Software: Sie leitet aus dem nächsten bekannten Verwandten ab, was der unbekannte Organismus "sein könnte". Das ist eine nützliche Annäherung – aber keine Messung. Interpolation bedeutet, dass das, was wir im Bericht sehen, teils echte Beobachtung und teils algorithmische Schätzung ist [163]. Beides ist im Endergebnis in der Regel nicht voneinander zu unterscheiden.
Schwerwiegender ist der Fall, in dem das Programm halluziniert: Es "identifiziert" ein Bakterium, das in der Probe gar nicht vorhanden ist, weil es dieses aufgrund von Sequenzähnlichkeit fälschlich einem Datenbankeintrag zugeordnet hat. Das tritt besonders bei Taxa geringer Abundanz auf, wo ein einziger "falscher Read" als prozentuale Präsenz im Bericht erscheinen kann. Das Phänomen ist nicht theoretisch: In Reproduzierbarkeitsstudien tauchen "nachgewiesene" Taxa regelmäßig in Negativkontrollen auf – die theoretisch keine Bakterien enthalten sollten [456].
Was bedeutet das für die Patientin und den Patienten?
Wenn jemand einen 16S-rRNA-basierten Mikrobiom-Test durchführen lässt, enthält der resultierende Bericht typischerweise bunte Kreisdiagramme, Prozentwerte und Referenzbereiche [162]. Die Interpretation erscheint verlockend einfach: Dieser Wert ist niedrig, wir liegen über oder unter dem "optimalen" Bereich. Die Realität ist jedoch erheblich komplexer.
Erstens ist die Festlegung eines "Referenzbereichs" nicht trivial. Das gesunde menschliche Mikrobiom weist eine außerordentlich hohe individuelle Variabilität auf – die Zusammensetzung der Darmmikrobiota zweier vollkommen gesunder Menschen kann sich auf Artebene erheblich unterscheiden, während beide funktionell stabil und gesund sind. Ein Vergleich mit einem "durchschnittlich gesunden" Mikrobiom kann daher irreführend sein: Das individuelle "Optimum" ist bei jedem Menschen ein anderes [325], [163], [162].
Zweitens zeigt die 16S-Analyse nur, wer anwesend ist – nicht, was diese tun [163]. Die Anwesenheit eines Bakteriums bedeutet nicht, dass es aktiv ist, dass es Metaboliten in funktionell relevanten Mengen produziert oder dass es aktuell an einem krankhaften Prozess beteiligt ist. Zwischen einer genetischen Karte und funktioneller Aktivität liegen mehrere Schritte – und keinen davon misst die 16S-Analyse.
Nichts davon bedeutet, dass der Test keinen Wert hätte. Im Vergleich mit sich selbst – mit derselben Methode, demselben Labor, demselben Probenahmeprotokoll, über die Zeit wiederholt – kann er tatsächlich zeigen, wie sich die Zusammensetzung des Mikrobioms als Reaktion auf eine Behandlung (etwa eine FMT) verändert. In dieser längsschnittlichen Verlaufsanwendung liegt heute der überzeugendste klinische Nutzen der 16S-Diagnostik [163].
Die fünf grundlegenden Grenzen der 16S-rRNA-Technologie
Neben ihrer technologischen Eleganz trägt die 16S-rRNA-basierte Amplikon-Sequenzierung fünf methodisch dokumentierte Grenzen in sich, die die klinische Verlässlichkeit betreffen:
1. Reagenzien- und Laborkontamination ("Kit-om"). DNA aus Laborkits, Reagenzien und Geräten kann ein Hintergrundrauschen erzeugen, das größer ist als das der Probe selbst – insbesondere bei Proben mit geringer Biomasse [456], [183]. Stuhlproben sind in der Regel reichhaltig genug, um Kontaminationen zu verdünnen, doch Haut- oder Schleimhautproben können erheblich verzerrt werden.
2. Geringe Biomasse – hoher Fehler. Je niedriger der Bakteriengehalt, desto höher der relative Anteil kontaminierender DNA, und das Ergebnis kann völlig irreführend werden [183]. Klinisch beeinflussen die Bedingungen der Probenentnahme (Zeitpunkt, Methode, Lagerung) das Ergebnis unmittelbar.
3. Die Wahl der V-Region beeinflusst das Profil. Die hypervariablen Regionen des 16S-Gens (V1–V2, V3–V4, V4, V6–V8 usw.) werden von unterschiedlichen "universellen" Primerpaaren angesteuert. Dieselbe Probe liefert bei Analyse mit unterschiedlicher V-Region-Ausrichtung unterschiedliche Gemeinschaftsprofile; bestimmte Bakteriengruppen werden von einer Region gut und von einer anderen schlecht erfasst [457]. Zwei Labore, die unterschiedliche Primer verwenden, können für dieselbe Patientin oder denselben Patienten unterschiedliche "Mikrobiotas" berichten.
4. Variabilität zwischen Laboren. Das MBQC-Konsortium (Microbiome Quality Control) zeigte, dass identische Proben, die in verschiedenen Laboren mit unterschiedlichen Kits und bioinformatischen Pipelines verarbeitet werden, erheblich abweichende Ergebnisse liefern [162]. Klinische Konsequenz: Tests verschiedener Anbieter sind nicht direkt vergleichbar.
5. Relative Anteile, keine absoluten Zahlen. 16S (und Shotgun) liefern kompositionelle Daten: die relativen Anteile der Taxa, nicht ihre absoluten Zellzahlen. Wenn ein Taxon im Bericht "zunimmt", kann das tatsächlich eine Abnahme anderer Taxa widerspiegeln [458]. Eine absolute Quantifizierung (qPCR oder Kalibrierung mittels Durchflusszytometrie) kann ein anderes Bild ergeben – ausführlich behandelt in Kapitel II.4.
Diese Grenzen entwerten die 16S-Analyse als Forschungsinstrument nicht, doch sie rechtfertigen interpretatorische Zurückhaltung bei klinischen Entscheidungen.
Die 16S-rRNA-Analyse gleicht am ehesten einer Karte, die nur die Namen von Städten zeigt – ohne Straßen, Verkehr oder den Zustand der Gebäude. Sie zeigt, wer im Darm anwesend ist, sagt aber nicht, was diese tun. Für klinische Entscheidungen reicht diese Karte allein selten aus.
Literatur
[162] Sinha R, Abu-Ali G, Vogtmann E et al. Assessment of Variation in Microbial Community Amplicon Sequencing by the Microbiome Quality Control (MBQC) Project Consortium. Nature Biotechnology. 2017. Link
Die Basisstudie des Microbiome Quality Control (MBQC) untersuchte die Variabilität der taxonomischen Profilierung über 15 Laboratorien und 9 bioinformatische Protokolle hinweg anhand verblindeter Stuhl-, Chemostat- und künstlicher Gemeinschaftsproben. Die Variabilität hing am stärksten von Typ und Herkunft der Bioprobe ab, gefolgt von DNA-Extraktion, Probenhandhabungsumgebung und bioinformatischer Pipeline. Analysen künstlicher Gemeinschaften zeigten quantitative Unterschiede in Extraktionseffizienz und bioinformatischer Klassifikation. Die Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit der Standardisierung, um Meta-Analysen populationsweiter Mikrobiomstudien zu ermöglichen.
[163] Gloor GB, Macklaim JM, Pawlowsky-Glahn V, Egozcue JJ. Microbiome datasets are compositional: and this is not optional. Front Microbiol. 2017. Link
Mikrobiom-Datensätze aus der Hochdurchsatzsequenzierung von 16S rRNA-Amplikons, Metagenomen oder Metatranskriptomen sind inhärent kompositionell, da das Messgerät eine willkürliche Gesamtsumme vorgibt. Die Übersichtsarbeit erläutert die Fehlerquellen, die entstehen, wenn kompositionelle Daten mit nicht-kompositionellen Methoden analysiert werden, und gibt Hinweise zur Anwendung der kompositionellen Datenanalyse über den gesamten Arbeitsablauf von Mikrobiomstudien hinweg. Der kompositionelle Rahmen wird als wesentlich und nicht optional für valide Schlussfolgerungen dargestellt.
[183] Eisenhofer R, Minich JJ, Marotz C et al. Contamination in Low Microbial Biomass Microbiome Studies: Issues and Recommendations. Trends Microbiol. 2019. Link
Um den Einfluss abnehmender mikrobieller Biomasse auf die Sequenzierung des 16S rRNA-Gens zu bewerten, erstellten die Autoren eine Verdünnungsreihe einer Mock-Community und testeten vier computergestützte Dekontaminationsansätze: Filterung anhand von Negativkontrollsequenzen, anhand der relativen Abundanz, anhand der inversen Korrelation mit der DNA-Konzentration (Decontam) und mittels Modellierung der Kontaminationsquellen (SourceTracker). Erwartungsgemäß stieg der Anteil kontaminierender bakterieller DNA mit sinkender Ausgangsbiomasse und erreichte in der am stärksten verdünnten Probe 80,1 %. Der Benchmark liefert praktische Orientierung für die Wahl von Dekontaminationsmethoden in Mikrobiomstudien mit geringer Biomasse und verdeutlicht die Grenzen von In-silico-Ansätzen.
[325] Falony G, Joossens M, Vieira-Silva S, et al. Population-level analysis of gut microbiome variation. Science. 2016. Link
Eine kurze Zusammenfassung der zitierten Publikation wird derzeit erstellt.
[456] Salter SJ, Cox MJ, Turek EM et al. Reagent and Laboratory Contamination Can Critically Impact Sequence-Based Microbiome Analyses. BMC Biology. 2014. Link
Kontaminierende DNA ist in gängigen DNA-Extraktionskits und Laborreagenzien allgegenwärtig und variiert in ihrer Zusammensetzung stark zwischen Kits und Chargen. Diese Kontamination verzerrt Ergebnisse aus Proben mit geringer mikrobieller Biomasse sowohl bei 16S rRNA-Gen-Untersuchungen als auch bei der Shotgun-Metagenomik in kritischem Ausmaß. Die Autoren liefern eine umfangreiche Liste potenziell kontaminierender Gattungen sowie Leitlinien zur Minderung und mahnen zur Vorsicht bei der Anwendung sequenzbasierter Techniken auf mikrobielle Umgebungen mit geringer Biomasse.
[457] Yang B, Wang Y, Qian PY. Sensitivity and Correlation of Hypervariable Regions in 16S rRNA Genes in Phylogenetic Analysis. BMC Bioinformatics. 2016. Link
Diese Studie entwickelte eine bioinformatische In-silico-Pipeline, um zu beurteilen, wie zuverlässig die hypervariablen Regionen des 16S rRNA-Gens die Volllängensequenz in der phylogenetischen Analyse repräsentieren, wobei die geodätische Distanz zur quantitativen Vergleichung der Topologie verschiedener phylogenetischer Bäume genutzt wurde. Das Hauptergebnis war, dass die Regionen V4–V6 für die phylogenetische Analyse der meisten bakteriellen Phyla am zuverlässigsten waren, während V2 und V8 am wenigsten zuverlässig waren.
[458] Vandeputte D, Kathagen G, D'hoe K et al. Quantitative Microbiome Profiling Links Gut Community Variation to Microbial Load. Nature. 2017. Link
Konventionelle sequenzierungsbasierte Analysen der Stuhlmikrobiota liefern nur relative Abundanzen, was die Verknüpfung von Mikrobiom-Merkmalen mit quantitativen Wirtsparametern erschwert, wenn die mikrobielle Last zwischen den Proben variiert. Die Autoren argumentieren, dass die relative Profilierung eine veränderte Gesamtabundanz der Mikrobiota als zentrales krankheitsassoziiertes Signal verdecken kann, und fordern eine quantitative Mikrobiom-Profilierung, die die relative Zusammensetzung mit Zelldichtebestimmungen kombiniert, um Wirt-Mikrobiota-Interaktionen tatsächlich charakterisieren zu können.