2. Secuenciación de amplicones basada en el 16S rRNA – Potente pero limitada
La secuenciación del 16S rRNA es barata y está bien validada, y revela de forma fiable los grandes grupos bacterianos, pero solo ve una parte del ecosistema intestinal.
A finales del siglo XIX, los geólogos comprendieron que los fósiles hallados en distintos estratos rocosos podían revelar cuándo vivieron determinadas especies. El método era brillante, pero tenía una limitación fundamental: solo podía retratar a los organismos que dejaban restos fósiles. Los moluscos, los hongos y la mayoría de los microbios desaparecían sin dejar rastro. El registro fósil era real, pero incompleto. El análisis del 16S rRNA funciona con una lógica parecida: muestra de forma fiable lo que puede mostrar, pero solo ve una parte del ecosistema intestinal [17].
El gen del ARN ribosómico 16S está presente en todos los procariotas, pero su secuencia difiere entre especies: eso es lo que hace posible la identificación bacteriana. En la secuenciación de amplicones se extrae el ADN de una muestra de heces, se amplifica un segmento definido del gen 16S (una llamada región variable, V1–V9) y después se secuencia. El resultado es un mapa de composición: qué taxón bacteriano está presente y en qué proporción dentro de la muestra [15].
Las ventajas del método son reales. Puede aplicarse a un gran número de muestras con un coste relativamente bajo. Funciona con bases de datos bien validadas (SILVA, Greengenes). Es capaz de identificar los filos más característicos del microbioma intestinal humano. Con fines de investigación —en particular en estudios poblacionales— es una herramienta consolidada [16].
El método tiene limitaciones clínicamente relevantes y documentadas desde el punto de vista metodológico. Se abordan en detalle en el apartado "Los cinco límites fundamentales" que figura más abajo. Merece la pena destacar una de ellas por separado:
Limitaciones en la identificación a nivel de especie: la mayoría de los análisis de 16S solo pueden identificar de forma fiable hasta el nivel de género; con frecuencia no es posible diferenciar a nivel de especie o de cepa [15]. Esto puede ser clínicamente crítico, ya que dentro de un mismo género pueden coexistir cepas patógenas e inocuas.
Imagine miles de sets de LEGO distintos con todas sus piezas lanzadas al aire a la vez y que, a partir de las piezas esparcidas por el suelo, tuviéramos que identificar exactamente qué sets había y cuántas piezas tenía cada uno. La dificultad se agrava porque no podemos recoger todas las piezas: algunas rodaron bajo la cama, otras quedaron pegadas entre sí y otras se parecen tanto a las demás que no se distinguen a simple vista. Esta es la esencia del análisis del 16S rRNA: leemos en el ADN intestinal qué "set" bacteriano había, pero solo examinamos un elemento característico de cada uno (una región variable del gen 16S), no el set completo. El resultado es una imagen real pero incompleta: muestra los grupos principales, pero los elementos parecidos pueden confundirse, las piezas que quedaron bajo la cama (cepas no cultivables) siguen siendo invisibles y no podemos saber con exactitud cuántas piezas había de cada set.
Algoritmos de análisis: interpolación y alucinación
Cuando un programa procesa los datos brutos de la secuenciación 16S —millones de fragmentos cortos de ADN— pasa por dos etapas críticas: el agrupamiento (formación de OTU o de ASV) y el emparejamiento con la base de datos [15], [18]. En la formación de OTU, las secuencias parecidas se agrupan en una sola unidad; el método de ASV, en cambio, tiene en cuenta las diferencias hasta el nivel de un solo nucleótido. Los dos enfoques identifican "especies" distintas a partir de los mismos datos.
En el emparejamiento con la base de datos, el programa asigna una secuencia desconocida a una bacteria conocida, pero solo si existe una referencia suficientemente próxima en la base de datos. Si no la hay, el programa interpola: deduce lo que el organismo desconocido "podría ser" a partir de su pariente conocido más cercano. Es una aproximación útil, pero no es una medición. La interpolación significa que lo que vemos en el informe es en parte observación genuina y en parte estimación algorítmica [15], [18]. Por lo general, ambas son indistinguibles en el resultado final.
Un caso más grave es aquel en el que el programa alucina: "identifica" una bacteria que en realidad no está presente en la muestra, tras haberla emparejado de forma incorrecta con una entrada de la base de datos por similitud de secuencia [49]. Esto ocurre sobre todo con los taxones de baja abundancia, en los que una única "lectura falsa" puede aparecer en el informe como una presencia porcentual. El fenómeno no es teórico: en los estudios de reproducibilidad, aparecen con regularidad taxones "detectados" en los controles negativos, que en teoría no deberían contener bacteria alguna [17].
¿Qué significa esto para el paciente?
Cuando alguien se hace una prueba del microbioma basada en el 16S rRNA, el informe resultante suele contener gráficos circulares llenos de color, porcentajes y bandas de referencia [15], [16]. La interpretación parece tentadoramente sencilla: este valor es bajo, estamos por encima o por debajo del intervalo "óptimo". La realidad, sin embargo, es bastante más compleja.
En primer lugar, definir un "intervalo de referencia" no es trivial [18], [16]. El microbioma humano sano muestra una variabilidad individual extremadamente alta: la composición de la microbiota intestinal de dos personas perfectamente sanas puede diferir hasta en un 90 %, y ambas ser funcionalmente estables y sanas. Por eso, la comparación con un microbioma "sano medio" puede resultar engañosa: el "óptimo" individual de cada persona es distinto.
En segundo lugar, el análisis del 16S solo muestra quién está presente, no qué está haciendo [18]. La presencia de una bacteria no significa que esté activa, que produzca metabolitos en cantidades funcionalmente relevantes ni que participe en este momento en un proceso patológico. Entre un mapa genético y la actividad funcional hay varios pasos, y el 16S no mide ninguno de ellos.
Nada de esto significa que la prueba carezca de valor. Comparada consigo misma —con el mismo método, el mismo laboratorio, el mismo protocolo de muestreo, repetida a lo largo del tiempo— puede mostrar realmente cómo cambia la composición del microbioma en respuesta a un tratamiento (como el FMT). Esta aplicación longitudinal, de seguimiento, es donde el diagnóstico por 16S tiene hoy su utilidad clínica más convincente [15], [18].
Los cinco límites fundamentales de la tecnología del 16S rRNA
Junto a su elegancia tecnológica, la secuenciación de amplicones basada en el 16S rRNA arrastra cinco límites documentados metodológicamente que afectan a la fiabilidad clínica:
1. Contaminación por reactivos y por el laboratorio ("kit-oma"). El ADN procedente de los kits de laboratorio, los reactivos y los equipos puede generar un ruido de fondo mayor que el de la propia muestra, sobre todo en muestras de baja biomasa [17], [471]. Las muestras de heces suelen ser lo bastante ricas como para diluir la contaminación, pero las muestras cutáneas o mucosas pueden quedar sustancialmente distorsionadas.
2. Baja biomasa, mayor error. Cuanto menor es el contenido bacteriano, mayor es la proporción relativa de ADN contaminante, y el resultado puede volverse por completo engañoso [471]. Desde el punto de vista clínico, las condiciones de recogida de la muestra (momento, método, conservación) influyen directamente en el resultado.
3. La elección de la región V afecta al perfil. Las regiones hipervariables del gen 16S (V1–V2, V3–V4, V4, V6–V8, etc.) son el blanco de distintos pares de cebadores "universales". La misma muestra analizada con distintas regiones V diana produce perfiles de comunidad diferentes; ciertos grupos bacterianos se detectan bien con una región y mal con otra [472]. Dos laboratorios que usen cebadores distintos pueden informar de "microbiotas" diferentes para el mismo paciente.
4. Variabilidad entre laboratorios. El consorcio MBQC (Microbiome Quality Control) demostró que muestras idénticas procesadas en laboratorios distintos, con kits y flujos bioinformáticos distintos, dan resultados sustancialmente diferentes [16]. Implicación clínica: las pruebas de distintos proveedores no son directamente comparables.
5. Proporciones relativas, no recuentos absolutos. El 16S (y la shotgun) generan datos composicionales: las proporciones relativas de los taxones, no sus recuentos celulares absolutos. Si un taxón "aumenta" en el informe, en realidad puede reflejar un descenso de otros taxones [23]. La cuantificación absoluta (calibración por qPCR o por citometría de flujo) puede dar una imagen distinta, algo que se aborda en detalle en el capítulo II.4.
Estos límites no invalidan el 16S como herramienta de investigación, pero justifican la prudencia interpretativa en la toma de decisiones clínicas.
El análisis del 16S rRNA se parece sobre todo a un mapa que solo muestra los nombres de las ciudades, sin carreteras, sin tráfico y sin el estado de los edificios. Muestra quién está presente en el intestino, pero no dice qué está haciendo. Para la toma de decisiones clínicas, este mapa por sí solo rara vez basta.
Referencias
[15] Jovel J, Patterson J, Wang W et al. Characterization of the human gut microbiome using 16S or WGS: a comparative study on the outcome of different analysis pipelines. Front Microbiol. 2016. Link
[16] Sinha R, Abu-Ali G, Vogtmann E et al. Assessment of Variation in Microbial Community Amplicon Sequencing by the Microbiome Quality Control (MBQC) Project Consortium. Nature Biotechnology. 2017. Link
[17] Salter SJ, Cox MJ, Turek EM et al. Reagent and Laboratory Contamination Can Critically Impact Sequence-Based Microbiome Analyses. BMC Biology. 2014. Link
[18] Gloor GB, Macklaim JM, Pawlowsky-Glahn V, Egozcue JJ. Microbiome datasets are compositional: and this is not optional. Front Microbiol. 2017. Link
[23] Vandeputte D, Kathagen G, D'hoe K et al. Quantitative Microbiome Profiling Links Gut Community Variation to Microbial Load. Nature. 2017. Link
[49] DeFilipp Z, Bloom PP, Torres Soto M et al. Drug-Resistant E. coli Bacteremia (the presence of bacteria in the bloodstream) Transmitted by Fecal Microbiota Transplant. N Engl J Med. 2019. Link
[471] Eisenhofer R, Minich JJ, Marotz C et al. Contamination in Low Microbial Biomass Microbiome Studies: Issues and Recommendations. mSystems. 2019. Link
[472] Yang B, Wang Y, Qian PY. Sensitivity and Correlation of Hypervariable Regions in 16S rRNA Genes in Phylogenetic Analysis. BMC Bioinformatics. 2017. Link